最近，美国FDA强调：目前在临床试验中基因工程抗体约占生物制剂的30%。重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子相融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒。重组技术的出现使筛选、人源化、抗体的生产得到革新，并取代杂交瘤技术，从而使以抗体为基础的药剂设计成为可能。
1975年，Kohler和Milstein发现的杂交瘤技术为抗体研究和临床应用开辟了新**。鼠杂交瘤是第一个单克隆抗体的可靠来源，并发展成为许多体内治疗的内用药。整个90年代，包括嵌合化、人源化的革命性的DNA重组技术增强了鼠抗体的临床效力，并引发了最近FDA批准治疗性免疫球蛋白（Ig）和Fab分子（通过蛋白质水解得到的单价抗体片段）上市的浪潮。这些进展还在持续进行，在2002年FDA批准了第一株用于肿瘤免疫治疗的放射性标记抗体（Zevalin）上市。
已批准的抗肿瘤、病毒、炎症性疾病的治疗性抗体数目不断增多，其中有30多中抗体已进入后期临床实验。最近，新的结构设计改进了体内药代动力学，拓宽了免疫学范围，并使得筛选抗非敏感性靶分子抗体，和蛋白质组矩阵成为可能。新的分子演化策略增强了抗体亲和力、稳定性、和表达水平。此综述描述了这些出现的技术，并讨论了大量以抗体为基础的、特异性针对人类健康和疾病的生物标记的基因工程制剂的发明。我们讨论了整个抗体分子的设计，重组片段。最后集中于有效治疗方式的最新技术，如放射性核素、药物、酶、以及疫苗诱导的表位。
完整抗体，及抗体的人源化
完整的抗体通常是多价的，它们与靶分子有高特异性和高亲和力。它们同时结合到两个相邻的抗原表位或分子，从而增强了亲和功能，并使抗体存留在体内（如细胞表面）的时间延长。完整的抗体包括Fc段，这对肿瘤的免疫治疗是非常重要的。Fc段可补充细胞毒效应分子功能，并可延长抗体在血清中的半衰期。尽管在体内重复应用未修饰的鼠单克隆抗体时会激发抗鼠免疫反应，鼠单抗还是成为FDA批准的第一批免疫制剂。人们应用了一些简单的策略以避免、掩盖或改变人的免疫监督机制。这些策略包括：将鼠的可变区与人的恒定区融合，组成嵌合抗体；通过去除T-细胞表位和将鼠抗体表面残基移植至人抗体骨架中，达到人源化。现代技术是从天然或合成库中筛选整个人抗体，包括能产单纯人抗体的转基因鼠。应用人抗体展示库在体外将鼠抗体改造成人源化衍生物，如FDA批准的第一株抗炎症反应全长人抗体D2E7。其它全长人抗体，包括治疗银屑病的Efalizumab，正在临床评估中。
仅为临床应用设计的“抗体片段”
由于细胞因子失活、受体封闭或病毒中和作用，Fc诱导的功能一般是不希望出现的。通过整个抗体蛋白水解产生单价Fab片段，可去除Fc段的这种功能。然而，蛋白水解不易产生比Fab片段小的分子。一般通过细菌来表达单链分子Fv(scFv)。scFv是可变区（VH和VL）通过弹性多肽接头稳定连接在一起的。与整个抗体分子相比，小抗体片段如Fab或scFv在药代动力学上表现出更好的组织穿透能力。同时由于抗原结合界面不变，抗体片段拥有全部结合特异性。然而，由于Fab和scFv都是单价的，它们在体内代谢速度快，并且在靶分子上停留时间短。因此，通过化学或基因交叉连接将Fab或scFv片段改造为二聚体、三聚体、四聚体复合物，以加强功能性亲和力。有多种方法可用于改造多聚scFv分子。其中最成功的设计是通过简单的缩短scFv接头长度来直接形成二价二聚体（diabodies,60kDa）, 三聚抗体（90kDa）、四聚抗体（120kDa）。实际上，scFv片段最初的临床实验是以多价分子出现的，因为它们表现出较高的亲和力，在早期临床研究中很成功。
完整抗体与抗体片段的药代动力学比较
体内抗体治疗的有效性，在肿瘤治疗中表现为抗体识别低水平肿瘤相关抗原的能力。免疫治疗在对抗循环系统肿瘤细胞时较对抗实体瘤细胞有效。这是因为抗体更容易接触到血液中的肿瘤细胞。如FDA批准的完整抗体分子中，Rituxan用于治疗非何杰金氏淋巴瘤；Campath和Mylotarg用于治疗白血病。只有两株抗体被批准用于实体瘤治疗：Herceptin用于治疗乳腺癌；PanoRex用于治疗结肠癌（德国）。尽管作用机制尚未明确，Herceptin可能是通过Fc受体和血管形成机制起作用，然而Rituxan是通过受体二聚化激活凋亡路径起作用。
放射性标记抗体在肿瘤影像和治疗中很重要，并可有效进行药代动力学评估。放射性核素的选择决定其用途。例如：标记钇-90的完整鼠抗体Zevalin可快速从体内清除，已被批准用于淋巴瘤治疗。治疗用药需要在作用部位较长的分解率，和缓慢的血液清除率之间保持一平衡状态。缓慢的血液清除率可导致放射性物质在肝脏聚集，同时使其它组织暴露在放射性物质中。对实体瘤的生物分配研究同样揭示，完整的抗体分子分子量过大（150kDa）,不能快速穿透肿瘤组织。最好的针对肿瘤的制剂有以下特征：属于中等大小的多价分子，有快速的组织穿透能力，在肿瘤部位作用时间长，并拥有快速的血液清除率。例如：双功能抗体（60kDa）与半衰期较短的同位素相连，由于清除率快被用于临床影像学。较大的分子，如小抗体（90kDa）,和半衰期较长的同位素相连，可在肿瘤部位达到较高浓度，适合用于肿瘤治疗。在早期临床研究中，Fab二聚体（110kDa）也是有效的。
将抗体与PEG融合，也就是PEG化可延长抗体片段的半衰期。完整放射性标记抗体片段在肾脏、肝脏的局限化成为一主要问题。研究证实放射性碘在掺入肾细胞之前，放射性核素可从抗体片段释放出来。放射性核素排泄很快，因此降低了肾脏的放射性物质剂量。新的代谢螯合物的发展将进一步改善针对肿瘤的重组抗体的药代动力学。对结合界面电荷进行修饰以改变等电点（pI），如糖基化，可降低组织（肾脏）吸收量。这些基因工程抗体片段在亲和力、肿瘤穿透力和生物分配方面的发展，必将推动针对治疗和影像学的新药剂的出现。
改造抗体片段的多种特异性
双特异抗体是将两个不同的结合特异性片段融合在一起形成的。例如；它可结合单一靶抗原的两个毗邻表位从而增强结合力。此外，双特异抗体可交叉连接两个不同的抗原，这在治疗中是非常有效的，特别是在肿瘤治疗中可补充细胞毒性T细胞数目。双特异抗体可通过两株杂交瘤细胞相融合成为“puadroma”细胞系产生。然而，这种技术非常复杂费时，还会产生不匹配的重链和轻链组合。更有效的方法是通过化学或基因结合或融合到粘性异二聚体结构域，如设计CH3结构域的方法将两个不同的Fab模体相偶连。双特异抗体为治疗提供了新的途径。
双功能抗体
最初的“魔弹”概念认为：抗体分子可与多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能。这些分子包括前面提到的放射性核素、细胞毒药物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒。对肿瘤治疗来说，设计的双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞。最新的抗体毒素复合物在体内很稳定，而且免疫原性很小。抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学。作为免疫脂质体，转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大脑。抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗。
抗体库的构建、展示和筛选
通过体外合成大库容的天然和合成免疫库产生的抗体库展示技术已逐步取代杂交瘤技术，用于筛选人抗体。通过将表现型和基因型相联系，从抗体库中可筛选到高亲和力的抗体，同时可找到编码此抗体的基因。一般抗体表达为单价Fab段或scFv片段，筛选后如果必要，可将抗体组装成完整的Ig或多价变异体。如果库容足够大，可直接筛选到高亲和力的Fab或scFv。但通常筛选到的基因型可通过突变和进一步筛选的多次循环来提高亲和力。此外，应设计新的筛选方法，以分离到有典型特征的特异性抗体。这些方法包括增强稳定性，表达量或激活受体的能力。
噬菌体展示技术
Fd噬菌体和Fd噬粒技术被广泛用于体外大容量抗体库的展示和筛选针对临床重要靶分子的高亲和力重组抗体。新的筛选方法在分离非敏感性抗原的相应抗体中证明是有效的。这些抗原包括：新的肿瘤相关抗原、细胞表面受体和HLA-A1递呈肽。筛选技术的重要发展包括微阵列筛选高亲和力抗体，以及从活细胞中筛选与细胞内受体结合的噬菌体。噬菌体技术已被用于以薄膜为基础的筛选，从而完成蛋白质组分析工作。
mRNA-蛋白质复合物库
核蛋白体展示依赖于抗体、核蛋白体和mRNA形成的稳定复合物，从而代替噬菌体作为展示平台。核蛋白体复合物是完全在体外构建的，因此去除了细胞转化的必要，并可产生<1014的大库容。应用此系统需要在完全没有RNA酶的环境下进行筛选，缓冲液的组成要适合抗体折叠。实际上，已经筛选到pM亲和力的抗体，并应用这一体外方法进行了快速亲和力成熟循环。应用嘌呤霉素化的mRNA-蛋白质复合物的共价展示技术是另一个可选择的核蛋白体展示技术。
细胞表面库
尽管<108的库容在筛选中受限，噬菌体系统出现之前，抗体被展示于细菌表面或内部用于筛选。随着高速流氏细胞技术的发展，细胞表面展示技术有了新的活力。通过这一方法分离得到了许多高亲和力抗体。
转基因鼠
转基因鼠缺乏鼠自身的免疫机制，代之以人的抗体系统。将抗原注射到鼠体内，经过在鼠体内的超突变和相对高亲和力筛选过程，产生人型抗体。可通过典型的杂交瘤技术得到抗体，或通过体外展示和筛选技术达到更有效的亲和力增强。
抗体的生产、稳定性和表达水平
用于早期临床和临床实验的抗体，其生产水平要通过大量表达系统进行评估。其中包括：细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞。细菌用于表达小分子非糖基化的Fab和scFv片段，并带有c-Myc、His或FLAG末端多肽，以利于亲和纯化。哺乳动物细胞或植物细胞用于表达完整的抗体，有时也用于表达scFv片段、双价抗体和微抗体。
亲和力成熟
一般转基因鼠和展示库产生的人抗体，其亲和常数（KD）在10-7M到10-9M之间。对于体外诊断、中和病毒、细胞打靶和体内影像来说，获得高亲和力抗体对于有效结合抗原分子是非常重要的。为增强抗体亲和力，可应用多种体外方法模拟哺乳动物体内抗体超突变和筛选过程。这些方法包括：以结构信息为基础的位点特异性突变，互补决定区（CDRs）的组合突变，整个基因的随机突变或链的迁移。
随着近十几年来展示库技术的发展，很明确最成功的方法依赖于突变、展示、筛选（复性）和基因扩增，多次循环过程。这些突变和筛选循环可通过体外或体内方法进行，而且在增强亲和力方面其结果要优于精确设计的变化。即使有最具体的结构信息，通过突变设计的精确互补界面技术还不成熟。
应用循环过程，亲和力增强被局限于抗原结合界面（CDR环）的突变。然而，重要的是，有时骨架区的突变使亲和力、稳定性和表达水平有较大程度的提高。整个V区基因的随机突变可能来自大肠杆菌突变子细胞；同源基因重排或错配PCR。在Fv内部两个V基因依次的链迁移过程也是随机的，但每次只有一个V区发生变化，同时其它区域保持稳定以提供一定的特异性。其它突变方式包括基因合成中掺入高突变酶，如无纠错功能的mRNA逆转录酶和DNA多聚酶以达到较高的基因突变率。将多聚酶整合进入核蛋白体展示和筛选过程可快速产生大量突变。
骨架替换
完整的抗体、Fab 和scFv片断可提供一个含有六个CDR环的抗原结合表面，在结合一系列的靶分子时，这六个CDR环可依次或同时发生改变。有些靶分子对免疫机制感应性差，特别是具有腔隙或缝隙的靶分子，需要抗体上有小的穿透环才能实现结合紧密。天然的哺乳动物抗体机制不编码穿透环，因此筛选到这类抗体的可能性非常小。然而，camelid(包括骆驼、骆马和相关种系)和鲨鱼都能产生天然的单一V区样基因，可表达有腔隙穿透能力的CDR环，这种CDR环与传统的抗体互补。这一理论使得体外设计V区或免疫球蛋白样骨架的单区域展示库成为可能。这些小分子可与抗体和肽库互补，而且在临床应用方面可改善药代动力学，并可到达酶、受体和病毒的免疫沉默位点或缝隙区域。一些重要的诊断靶分子，如朊病毒，对传统的抗体敏感性差。我们希望通过应用新的分子库和骨架可获得与之相结合的分子。
临床应用
除了前面说到的放免治疗，基因工程抗体还有许多其它的临床应用。其中包括：病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗。
中和病原体及抗病毒治疗
抗体结合作用可直接并有效封闭多种病原体活性，此过程不需要Fc段介导的细胞毒作用，一般是通过抗体介导的病毒中和作用发生效应的。第一株用于治疗病毒性疾病的抗体Synagis是FDA在1998年批准用于临床的。Synagis是一株用于控制严重的呼吸道合疱病毒（RSV）疾病的人源化抗体。尽管现在有大量抗人免疫缺陷病毒1（HIV）和单纯疱疹病毒抗体，应用重组抗体治疗病毒感染还是受到一定限制。只有少量抗体在体外和抗病毒动物模型现出潜在的中和活性。这可能是由于病毒产生逃逸突变体，并诱导受体表面产生免疫沉默。对于中和其它病原分子，FDA已批准Fab单体分子作为抗蛇毒药物；scFv片段和寡克隆复合物作为抗细菌毒素药物。
细胞内抗体
抗体片段可作为细胞内蛋白表达，最典型的是scFv，被称为内抗体。ScFv可装载目的信号以中和细胞内基因产物或一定的信号传导途径。例如：应用抗体可分别下调p21ras、erbB2、huntingtin和MHC表达。内抗体有重要的抗病毒作用。它们通过针对细胞内行为来控制病毒蛋白，如Vif、Tat或HIV的Rev成分。通过改造抗体骨架可在细胞内环境中增加抗体表达量和可溶性。通过抗体库的体内筛选分离出许多以前未知细胞内抗体或内抗体。显然，内抗体基因可插入基因治疗载体中，从而在体内表达，并最终应用于临床治疗。
肿瘤治疗与细胞补充疗法
前面已经提到放射性标记抗体在肿瘤治疗中的应用。通过抑制血管形成来控制肿瘤生长已成为一个重要的策略。通过补充表达细胞表面抗体(通常是scFv)的细胞毒T细胞、自然杀伤（NK）细胞或巨噬细胞可杀伤肿瘤细胞。此外，细胞补充策略包括补充带有细胞因子的双功能抗体，从而使肿瘤部位的T细胞活化并增殖。
疫苗应用
金抗体是改造的疫苗抗体。它包括隐含的T细胞表位以增强抗原展示作用。金抗体有效针对抗原递呈细胞（APCs），通过递呈作用暴露隐含的T细胞表位，从而直接激活T细胞。一般Fv区域可特异性结合APC，C区域编码隐含的T细胞表位。通过再设计，这些新疫苗可针对不同的APC细胞，并增强不同T细胞表位的免疫作用。此外，可设计以B7为目标的结构域（scFv和Vl区域）从而将抗原运送到树突状细胞。
用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术
人们预言到2005年，生物传感器和微阵列技术将成为主要的体外诊断技术。对于大量诊断试剂盒，抗体有高敏感性。每年用于诊断产业的200亿美元中，近30%与抗体有关。从最初的玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界面，用于诊断的抗体微矩阵界面不断发展。随着体外机械人的出现，这一技术将进一步发展，并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。
